1/ khái niệm
- Phương pháp lai Northern blot là phương pháp áp dụng cho RNA, lai DNA-RNA hoặc RNA-RNA.
- Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA.
- Kỹ thuật lai Northern blot được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine, David Kemp, và George Stark tại Đại học Stanford.
2/ Thủ tục:
- Bắt đầu với khai thác của tổng số RNA từ một mẫu mô đồng nhất hoặc từ các tế bào. Nhân điển hình mRNA sau đó có thể được cô lập thông qua việc sử dụng các phương pháp sắc ký oligo (dT) cellulose để cô lập chỉ những RNA với poly (A) đuôi. Mẫu RNA sau đó được phân cách bằng gel điện.
- Các mẫu RNA, bây giờ tách ra theo kích cỡ, được chuyển giao cho một màng nylon thông qua một hệ thống mao mạch hoặc máy hút thấm.
- Mao dẫn thấm thiết lập hệ thống cho việc chuyển giao RNA từ gel điện đến một màng thấm.
- Các bộ đệm chuyển giao sử dụng cho thấm thường chứa Formamide bởi vì nó làm giảm nhiệt độ ủ của sự tương tác thăm dò-RNA, do đó loại bỏ sự cần thiết cho nhiệt độ cao, có thể gây suy thoái RNA.
- Sau khi RNA đã được chuyển giao cho màng, nó được cố định thông qua các liên kết cộng hóa trị với màng bằng ánh sáng tia cực tím hoặc nhiệt.Sau đó, nó được lai với RNA trên màng.
- Điều kiện thí nghiệm có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của lai bao gồm sức mạnh ion, độ nhớt, độ dài song công, cặp base sai, và thành phần cơ bản.
